| 以化橘紅為基源的一類(lèi)新藥柚皮苷的臨床前研究 |
| 瀏覽次數(shù)：2102次 發(fā)布日期：2016-11-19 8:55:52 |
 柚皮苷是從中藥化橘紅中提取、分離、純化得到的有效單體?；偌t是“十大廣藥”之一，應(yīng)用歷史悠久，歷代本草多有記載，自古以來(lái)就有“南方人參”和“一片值千金”之說(shuō)?；偌t性溫味辛、苦，具理氣寬中、燥濕化痰之功，用于咳嗽痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶，含黃酮、香豆素、揮發(fā)油等成分。本團(tuán)隊(duì)前期的研究表明，化橘紅總黃酮具有明顯止咳、祛痰、平喘和抗炎作用；其鎮(zhèn)咳方式不是中樞性鎮(zhèn)咳，鎮(zhèn)咳作用也不依賴(lài)于氣管內(nèi)C纖維P物質(zhì)，而是與快速適配受體（RARs）的放電有關(guān)；且對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)、Beagle犬心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)無(wú)不良影響。在此基礎(chǔ)上本課題組利用指紋譜效學(xué)方法研究了化橘紅止咳、化痰作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)了柚皮苷這一活性物質(zhì)……。10余年來(lái)本課題組按照國(guó)家一類(lèi)新藥注冊(cè)的技術(shù)要求，對(duì)柚皮苷開(kāi)展了新藥臨床前研究，獲得了一類(lèi)新藥臨床批件，現(xiàn)綜述如下。 1.1 鎮(zhèn)咳作用 本團(tuán)隊(duì)選用多種實(shí)驗(yàn)性咳嗽模型，開(kāi)展了柚皮苷鎮(zhèn)咳作用及機(jī)制的研究。主要藥效學(xué)研究表明，柚皮苷及其主要代謝產(chǎn)物柚皮素對(duì)氨水誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性咳嗽有顯著的鎮(zhèn)咳作用。有關(guān)柚皮苷鎮(zhèn)咳作用部位的研究表明，柚皮苷靜脈注射對(duì)電刺激豚鼠喉上神經(jīng)所致咳嗽沒(méi)有影響，柚皮苷腦室注射對(duì)電刺激豚鼠氣道神經(jīng)所致咳嗽也沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明柚皮苷的鎮(zhèn)咳部位不是在中樞，其鎮(zhèn)咳方式應(yīng)該為外周性鎮(zhèn)咳。進(jìn)一步的鎮(zhèn)咳作用靶點(diǎn)研究結(jié)果表明，柚皮苷對(duì)電刺激辣椒素脫敏豚鼠和非脫敏豚鼠的迷走神經(jīng)所致咳嗽的抑制作用無(wú)明顯差異，說(shuō)明C纖維神經(jīng)肽的耗竭對(duì)柚皮苷的鎮(zhèn)咳作用無(wú)明顯影響，提示柚皮苷的鎮(zhèn)咳作用不依賴(lài)于C纖維神經(jīng)肽的釋放；ATP－K＋離子通道特異性阻斷劑格列苯脲對(duì)柚皮苷抑制辣椒素所致豚鼠咳嗽的作用也無(wú)顯著影響，提示柚皮苷也不是通過(guò)開(kāi)放ATP－K＋離子通道而起鎮(zhèn)咳作用的；柚皮苷灌胃給藥對(duì)豬鬃毛機(jī)械刺激辣椒素脫敏豚鼠呼吸道黏膜所致咳嗽具有顯著抑制作用，提示柚皮苷的鎮(zhèn)咳作用與抑制快速適配受體（RARs）有關(guān)。此外，柚皮苷能顯著降低慢性煙熏（8周）所致的慢性支氣管炎豚鼠的氣道高反應(yīng)性和對(duì)辣椒素的咳嗽敏感性，并顯著抑制肺部炎性因子的分泌和提高肺部抗氧化水平；且其抑制慢性煙熏（8周）所致的咳嗽敏感性增高的作用不弱于臨床常用的外周性鎮(zhèn)咳藥左羥丙哌嗪和莫吉司坦。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，柚皮苷抑制慢性煙熏所致的慢性支氣管炎豚鼠的咳嗽敏感性提高，是與其抑制煙熏誘導(dǎo)的肺組織SP含量和NK－1受體表達(dá)增加、抑制肺組織NEP酶活性的下降、進(jìn)而降低慢性煙熏所致氣道神經(jīng)源性炎癥水平有關(guān)。上述研究結(jié)果提示，柚皮苷及其主要代謝產(chǎn)物柚皮素不僅對(duì)生理狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)性咳嗽具有良好的抑制作用，而且對(duì)慢性氣道炎癥等病理狀態(tài)下的咳嗽也具有顯著鎮(zhèn)咳作用；此外，對(duì)氣道神經(jīng)源性炎癥誘發(fā)的咳嗽，也具有明顯抑制作用。 1.2 化痰作用 本團(tuán)隊(duì)采用體內(nèi)外藥理模型，探討了柚皮苷及柚皮素的化痰作用及其機(jī)制。小鼠氣道酚紅排泌法研究結(jié)果顯示，柚皮苷的主要代謝產(chǎn)物柚皮素對(duì)小鼠氣道酚紅排泌具有顯著促進(jìn)作用；氣管纖毛運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)結(jié)果表明，柚皮素能顯著促進(jìn)家鴿氣道纖毛的轉(zhuǎn)運(yùn)功能；體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯拷Y(jié)果顯示，柚皮素能顯著抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的體外大鼠氣管組織黏蛋白的分泌，提示柚皮苷的主要代謝產(chǎn)物柚皮素具有明顯化痰作用。此外，我們采用LPS誘導(dǎo)動(dòng)物肺部急性炎癥模型，考察了柚皮苷對(duì)急性肺部炎癥動(dòng)物痰液分泌量及黏蛋白含量等指標(biāo)的影響，結(jié)果表明柚皮苷能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的Beagle犬氣管內(nèi)痰液分泌量和固形物含量的增加，增加痰液的彈性；并明顯抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的肺泡灌洗液中MUC5AC的含量和小氣道中杯狀細(xì)胞的增生。另外我們采用EGF誘導(dǎo)A549細(xì)胞MUC5AC黏蛋白高分泌的體外模型研究柚皮苷的化痰機(jī)制，結(jié)果表明柚皮苷能顯著抑制EGF誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EGFR、ERK1／2、p－38 MAPK與JNK的磷酸化以及NF－KB與AP－1的入核，提示柚皮苷抑制黏蛋白MUC5AC的高分泌與其抑制MAPKs／AP－1以及IKKs／IκB／NF－κB信號(hào)通路的協(xié)同作用相關(guān)?？梢?jiàn)柚皮苷及其主要代謝產(chǎn)物柚皮素既能通過(guò)促進(jìn)漿液的分泌以稀釋痰液，又能促進(jìn)氣道纖毛的轉(zhuǎn)運(yùn)功能以促進(jìn)痰液的排出，還能通過(guò)抑制粘蛋白的分泌以降低痰液的粘稠度，從多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，最終達(dá)到化痰的目的。 1.3 抗炎作用 病理性咳嗽和咯痰是多種呼吸系統(tǒng)疾病的常見(jiàn)癥狀，常與呼吸系統(tǒng)的炎性刺激有關(guān)。因此，抗炎是治療咳嗽和咯痰的重要措施。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)柚皮苷在治療呼吸系統(tǒng)疾病方面的價(jià)值，我們采用體內(nèi)外藥理模型，探討了柚皮苷的抗炎作用及其機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：柚皮苷能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠和Beagle犬急性肺部炎癥及百草枯誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷；柚皮苷也能顯著抑制慢性煙熏誘導(dǎo)的大鼠和豚鼠呼吸系統(tǒng)慢性炎癥，并能增加煙熏誘導(dǎo)的慢性支氣管炎模型豚鼠肺泡灌洗液中血清脂氧素A4的濃度，以促進(jìn)炎癥的消退。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，柚皮苷不僅能抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺部炎癥，還能抑制慢性煙熏誘導(dǎo)的呼吸系統(tǒng)慢性炎癥；不僅能抑制炎癥，還能促進(jìn)炎癥的消退。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：柚皮苷能抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子IL－8、MCP－1和MIP－1α，其機(jī)制可能與抑制NF－κB和MAPK信號(hào)通路的活化有關(guān)。 1.4 抗肺纖維化
肺纖維化是由多種原因引起的嚴(yán)重彌漫性肺部炎性疾病，其常見(jiàn)病因有慢性阻塞性肺疾病、放射性肺炎、過(guò)敏性肺炎、百草枯肺和塵肺等。其發(fā)病機(jī)制包括肺泡上皮細(xì)胞受損、炎癥細(xì)胞聚集和活化、細(xì)胞凋亡和纖維細(xì)胞增生及膠原產(chǎn)生等。我們采用百草枯多次腹腔注射致小鼠肺纖維化模型考察了柚皮苷的抗肺纖維化作用，結(jié)果表明，柚皮苷能顯著降低百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠肺組織中TNF－α、TGF－β1、MMP－9、TIMP－1、HYP和MDA的含量，并顯著提高SOD、GSH－Px、HO－1抗氧化酶的活性，提示柚皮苷對(duì)百草枯誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化具有抑制作用。 2.1 吸收 我們以746.7 mg?kg－1的劑量給大鼠灌胃給予柚皮苷，采用高效液相－質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)大鼠血漿中柚皮苷及其代謝產(chǎn)物柚皮素，結(jié)果表明，給藥后5min即可檢測(cè)到柚皮苷，其Tmax為45min，隨后柚皮苷的血漿濃度快速下降；而柚皮苷的代謝產(chǎn)物柚皮素在血漿中的濃度緩慢升高，其Tmax為9h；柚皮苷、柚皮素的Cmax分別為（3782.50±986.82）、（227.05±88.41）ng?mL－1。而分別以30、90、270mg?kg－1的劑量給大鼠灌胃給予柚皮素，采用高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定大鼠血漿中柚皮素及其葡萄糖醛酸結(jié)合物的血藥濃度，3個(gè)劑量總柚皮素（游離柚皮素及其葡萄糖醛酸結(jié)合物的總和）的AUC0－48分別為30990.94、132992.70和463107.43ng?mL－1?h－1，且給藥后的藥－時(shí)曲線(xiàn)呈雙峰現(xiàn)象，其可能與肝腸循環(huán)有關(guān)。 2.2 與血漿蛋白的結(jié)合 采用平衡透析法考察柚皮苷、柚皮素與大鼠、犬及人血漿蛋白體外結(jié)合率的研究結(jié)果表明，在93.40～4670.00ng?mL－1范圍內(nèi)，柚皮苷在大鼠、犬和人血漿中的蛋白結(jié)合率不隨濃度變化而變化，柚皮苷與大鼠血漿蛋白的結(jié)合率為83.30％～84.56％，具有高強(qiáng)度結(jié)合率，與犬、人血漿蛋白結(jié)合率分別為48.71％～51.33％和72.14％～74.06％，二者均為中等強(qiáng)度結(jié)合率，說(shuō)明柚皮苷的血漿蛋白結(jié)合率表現(xiàn)出一定的種屬差異；而在118.40～11940.00ng?mL－1范圍內(nèi)，柚皮素在大鼠、犬和人血漿中的蛋白結(jié)合率不隨濃度變化而變化，柚皮素與大鼠、犬、人血漿蛋白的結(jié)合率分別為94.68％～96.04％、93.19％～93.92％和97.53％～100.00％，均為高強(qiáng)度結(jié)合率，且沒(méi)有表現(xiàn)出種屬差異。 2.3 分布 柚皮苷的組織分布研究結(jié)果表明，大鼠灌胃給予柚皮苷后，柚皮苷及柚皮素會(huì)廣泛分布于除腦以外的各主要器官，且肺部和氣管中分布較多。 2.4 代謝與排泄 柚皮苷的代謝及排泄實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，Beagle犬口服給予柚皮苷后，采用HPLC－ESI－Q－TOF法在尿、糞和膽汁中檢測(cè)到22種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物從結(jié)構(gòu)上可分為三類(lèi)，即以柚皮苷為母核的代謝物，包括柚皮苷原型、柚皮苷的氧化、甲基化、還原以及乙酰化產(chǎn)物；以柚皮素為母核的代謝物，包括柚皮素氧化、還原、葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸酯結(jié)合以及葡萄糖結(jié)合產(chǎn)物；以柚皮素C環(huán)斷裂后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，主要是C環(huán)開(kāi)裂后產(chǎn)生的各種酚酸及其氧化、結(jié)合產(chǎn)物。大鼠灌胃柚皮苷后，采用HPLC－ESI－Q－TOF法在尿、糞和膽汁中檢測(cè)到18種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物從結(jié)構(gòu)上也分為以柚皮苷為母核的代謝物、以柚皮素為母核的代謝物及柚皮素C環(huán)斷裂后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物三類(lèi)。此外，采用人糞便勻漿液孵育柚皮苷，并通過(guò)RRLC－MS／MS法監(jiān)控孵育體系中柚皮苷及其主要代謝物柚皮素和對(duì)羥基苯丙酸濃度的變化情況，研究結(jié)果表明：柚皮苷經(jīng)人腸道微生物代謝依次轉(zhuǎn)變成柚皮素和對(duì)羥基苯丙酸，但發(fā)現(xiàn)部分人群的腸道微生物不能降解對(duì)羥基苯丙酸，而不能降解對(duì)羥基苯丙酸的7例腸道微生物的提供者隨機(jī)地分布于不同性別和不同的省份，說(shuō)明降解對(duì)羥基苯丙酸能力缺陷的人群廣泛隨機(jī)分布。 我們按照GLP的要求，開(kāi)展了SD大鼠經(jīng)口給予柚皮苷的急性、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)研究。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，以柚皮苷的最大可給藥濃度、最大給藥容積單次灌胃給予大鼠（給藥劑量為16g?kg－1），給藥后14d觀察期內(nèi)未見(jiàn)死亡，一般狀況良好，體質(zhì)量及攝食量正常；血液學(xué)、血凝、血生化等各項(xiàng)指標(biāo)均未見(jiàn)異常改變，大體解剖也未見(jiàn)與供試品相關(guān)的病理改變，說(shuō)明柚皮苷單次給藥對(duì)SD大鼠基本無(wú)毒。亞慢性（13周）和慢性毒性（6個(gè)月）試驗(yàn)研究結(jié)果表明，SD大鼠經(jīng)口給予柚皮苷未觀察到臨床不良反應(yīng)的劑量水平（NOAEL）＞1250mg?kg－1?d－1。此外，毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，以柚皮苷50、250、1250mg?kg－1三個(gè)劑量經(jīng)口給予SD大鼠，雄性大鼠在給藥3個(gè)月、雌性大鼠在給藥6個(gè)月基本達(dá)到最大程度的暴露，總柚皮苷（柚皮苷和柚皮素之和）在雌雄大鼠體內(nèi)的暴露水平未見(jiàn)明顯差異；以柚皮苷20、100和500mg?kg－1三個(gè)劑量經(jīng)口給予Beagle犬，雄性Beagle犬在給藥1個(gè)月，雌性Beagle犬在給藥1～3個(gè)月對(duì)總柚皮苷基本達(dá)到最大程度的暴露?？傝制ぼ赵诖?、雄性Beagle犬體內(nèi)的暴露水平未見(jiàn)明顯性別差異。 按照國(guó)家一類(lèi)新藥注冊(cè)的技術(shù)要求，我們對(duì)柚皮苷進(jìn)行了系統(tǒng)的臨床前成藥性研究。研究結(jié)果表明，作為治療各種原因引起的有痰或無(wú)痰咳嗽的藥物，柚皮苷具有如下特點(diǎn)： ①柚皮苷可以作用于多個(gè)靶點(diǎn)，既具有鎮(zhèn)咳作用，又具有化痰作用，還能抗呼吸道炎癥，是一種治療呼吸系統(tǒng)疾病的多靶點(diǎn)藥物； ②柚皮苷具有顯著的外周性鎮(zhèn)咳作用，其鎮(zhèn)咳作用不弱于臨床常用的外周性鎮(zhèn)咳藥左羥丙哌嗪和莫吉司坦；此外，柚皮苷不僅對(duì)慢性氣道炎癥引起的咳嗽具有顯著抑制作用，而且能抑制氣道高反應(yīng)性、氣道免疫性炎癥和神經(jīng)源性炎癥，提示柚皮苷不僅可用于治療急性咳嗽，還可用于神經(jīng)源性炎癥介導(dǎo)的咳嗽和慢性支氣管炎等疾病的高敏性咳嗽等；且柚皮苷鎮(zhèn)咳作用機(jī)制明確，主要與抑制快速配適受體（RARs）有關(guān)； ③柚皮苷具有顯著祛痰作用，既能通過(guò)促進(jìn)漿液的分泌以稀釋痰液，又能促進(jìn)氣道纖毛的轉(zhuǎn)運(yùn)功能以促進(jìn)痰液的排出，還能通過(guò)抑制杯狀細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)化及減少粘蛋白（MUC5AC）的生成和分泌以降低痰液的粘稠度，從多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，最終達(dá)到祛痰的目的，有利于具有粘蛋白高分泌病理特征的慢性呼吸道疾病的治療； ④柚皮苷不僅能抑制氣道炎癥的發(fā)生，還能促進(jìn)炎癥的消退以改善對(duì)呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病的恢復(fù)能力； ⑤柚皮苷具有良好的安全性。總之，柚皮苷的成藥性好，與臨床現(xiàn)有藥物相比具有明顯優(yōu)勢(shì)。 |
橘紅研究